作者：李天东，古静燕，罗英，李俊刚
【摘要】 目的分离纯化中华芦荟中具有细胞增殖抑制和细胞凋亡诱导活性的活性成分。方法反复采用硅胶柱色谱、凝胶色谱从芦荟中分离得到4个化合物，根据理化性质及波谱方法鉴定了结构，并以k562肿瘤细胞株采用形态学、流式细胞仪和srb法分析了化合物的体外抗肿瘤作用。结果4种化合物分别鉴定为芦荟大黄素①，大黄素甲醚②，大黄酚③和大黄素④。活性检测结果化合物1有较强的体外抗肿瘤活性［10μg/ml时抑制率为(57.13±2.13)% ］, 化合物4在10 μg /ml时抑制率为(35.17 ± 1.16)%，化合物2、3（均为10μg /ml）的抑制率分别为［（18.14 ± 1.15)%， (21.13 ± 3.11)% ］。结论化合物1，2，3，4都具有细胞增殖抑制活性，其中1和4活性较强，2，3的活性较弱。
【关键词】 中华芦荟 抗肿瘤 细胞增殖抑制
abstract：objectiveto isolate and purify the active antitumor components from aloe vera var. chinesis susing silica gel column repeatly ,sephadex lh-20,four components were islotated from aloe vera var chinesis berg. by means of physico -chemical properties and spectral analysis, and their structures were determined . the anti-tumor activities of these compounds were evaluated in vitro by srb and flowed cytometry using human leukemia carcinoma cell sthese components were identified as aloe - emodin, physcion,chrysophanol, showed that 5μg/ml compound 1, 10μg /ml compound 2,3,4 could resisit cancer sionall four components can inhibit the growth of the cancer cell. both aloe - emodin and emodin show strong activity , while physcion and chrysophanol show weak activity.
key words： aloe vera var. chinesis berg.; antitumor; cell prolifation inhibition 芦荟是百合科芦荟属a loe l.多年生长绿肉质多浆植物，原产于非洲，种类约有五百多种，我国常见库拉索芦荟、中华芦荟、木立芦荟和开普芦荟，多用于观赏植物或是美容保健品［1］。文献报道，该属植物具有广泛的生理活性，如抗癌、抗菌、抗炎、免疫增强等功效［2］。20世纪中期国外对芦荟的化学成分进行了广泛的研究，已报道蒽醌类、色原酮、生物碱、有机酸和多糖类等多种生理活性物质。中华芦荟又称斑纹芦荟，国内对其化学成分进行了一定的研究，如袁阿兴等［3］发现芦荟苦素,但对其抗肿瘤化学成分研究尚未见报道。本文从中华芦荟中分离得到4个化合物，芦荟大黄素①、大黄素甲醚②，大黄酚③和大黄素④，并以k562肿瘤细胞株，采用流式细胞仪和srb法结合显微镜检测细胞形态学变化的方法，测定了4个蒽醌类化合物的体外细胞周期抑制和细胞凋亡诱导活性,首次报道了大黄素甲醚和大黄酚的体外抗肿瘤活性。
1 材料与仪器 x4 型显微熔点仪，温度未校正；jeol jnm-ecp600型核磁共振波谱仪，tms为内标。sephadex lh-20、薄层硅胶和层析用硅胶分别为pharmacia公司和青岛海洋化工厂产品。活性测试采用人慢性髓原白血病肿瘤细胞k562、胎牛血清(fbs)、rpmi-1640 细胞培养基为hyclone 公司和g ibcobrl 公司产品；磺酰罗丹明b(srb) 为sigma 公司产品。中华芦荟aloe vera var chinesis berg购自四川绵阳仙游花卉有限公司，由绵阳师范学院生命科学与技术学院陈桂芳副教授鉴定。
2 方法与结果
2.1 化合物的分离与纯化
2.1.1 提取与分离 中华芦荟叶汁浓缩物（1.5kg）以酸性氯仿7.5l提取4h，多次提取(10次以上)，浓缩提取液将其溶于乙醇与水的混合液，依次用石油醚、氯仿、醋酸乙酯分别萃取。氯仿提取物79g，经硅胶柱色谱多次分离（石油醚-醋酸乙酯梯度洗脱）及sephadex lh-20柱色谱（甲醇洗脱）及多次重结晶分离纯化得到化合物1（76mg）、化合物2（20 mg）、化合物3（12 mg）和化合物4（17 mg）。
2.1.2 结构鉴定化合物1:橙黄色针状结晶（乙醇），mp219～220℃。1h-nmr（dmso，600 mhz）δ：11.97（1h,s）, 11.91（1h,s），7.80（1h,dd），7.72（1h,dd），7.69（1h,d），7.38（1h,dd），7.30（1h,d），5.62（1h,s），4.63（2h,s）；13c-nmr（dmso，150 mhz）δ：191.74，181.59，161.72，161.43，153.80，137.42，133.54，124.49，120.78，119.43，117.18，116.01，114.57，113.22，62.15。与文献［4］对照确定为芦荟大黄素，其分子式为c15h10o5。 化合物2:橙黄色针状结晶(甲醇)，mp197～198℃。1h-nmr（cdcl3,600 mhz）δ：12.30（1h, s），12.10（1h, s），7.61（1h,s），7.35（1h, d），7.08（1h,d），6.68（1h,d），3.94（3h,s），2.46（3h, s）； 13c-nmr（cd3 cl3，150 mhz ）δ：190.8，181.9，166.5， 165.2，162.5， 148.4，135.2， 133.2，124.5，121.2，113.7，110.2，108.2，106.8，22.1。与文献［5］对照确定为大黄素甲醚，其分子式为c16h12o5。 化合物3：黄色片状结晶（乙醇），mp 196～197℃（乙醇）。1h-nmr（cdcl3，600 mhz）δ：11.97（1h，s），11.87（1h，s），7.80（1h，dd），7.71（1h，dd），7.55（1h，dd），7.38（1h，dd），7.22（1h，dd），2.44（1h，dd）；13c-nmr（cdcl3，150 mhz）δ：192.6，182.0，162.7，162.4，149.4，136.9，133.7，133.4，124.6，124.4，121.4，119.9，115.9，113.8，22.3。与文献［5］对照确定为大黄酚，其分子式为c15h10o4。 化合物4：黄色针晶，mp 256～258℃（乙醇）。1h-nmr（dmso，600 mhz）δ：12.08（1h，s），12.01（1h，s），11.37（1h，s），7.49（1h，dd），7.16（1h，dd），7.12（1h，dd），6.59（1h，dd），2.41（1h，dd）；13c-nmr（dmso，600 mhz）δ：190.8， 181.2，165.3，165.3，162.3，148.6，134.7，133.3，124.0，120.5，113.5，108.7，107.9， 108.7，21.0。与文献［5］对照确定为大黄素，其分子式为c15h10o5。
2.2 化合物的抗肿瘤活性实验
2.2.1 生物活性测试方法采用人慢性髓原白血病肿瘤细胞k562，按照文献［6，7］采用srb( sulfo rhodamine b, 磺酰罗丹明b) 法, 结合显微镜观察细胞形态学变化(顺铂做阳性对照)，测定了4个化合物的体外抗肿瘤活性。
2.2.2 抗肿瘤活性结果表明，镜下观察，芦荟大黄素、大黄素有细胞凋亡诱导活性，其中芦荟大黄素活性较为明显，100 μg/ml时镜下可见较多典型的凋亡小体，而大黄素则在100 μg/ml时出现凋亡小体，而大黄酚、大黄素甲醚均无明显的细胞凋亡诱导活性。化合物1在10 μg/ml 时有较强的体外抗肿瘤活性［ 抑制率为(57.13±2.13)%］, 化合物4在10 μg /ml时抑制率为(35.17 ± 1.16)%，化合物2、3的体外抗肿瘤活性较弱，测试浓度为10 μg/ml时抑制率分别为( 18.14 ± 1.15)%，(21.13 ± 3.11)%。
3 讨论 研究表明芦荟中蒽醌类化合物具有抗肿瘤活性，且大黄素、大黄素的抗肿瘤活性已见报道［8，9］，但是对芦荟中大黄素甲醚、大黄酚抗肿瘤活性尚未见报道，本文采用k562肿瘤细胞株首次报道了这2个化合物的体外抗肿瘤活性。本文研究表明芦荟大黄素①、大黄素甲醚②、大黄酚③和大黄素④均有细胞增殖抑制活性，但是其取代基团的位置和性质对化合物抗肿瘤活性的显著影响有待于进一步研究。 致谢：核磁共振谱和抗肿瘤活性由中国海洋大学食品与海洋药物研究所代测，特此致谢！
【参考文献】 ［1］马兰花，史国富.芦荟提取物在防治肿瘤中的研究进展［j］.中医药研究,2002,18(2):59. ［2］李天东，陈桂芳，韩文君.芦荟的药理作用及其应用研究进展［j］.中国现代医学杂志,2007,12(23):2881. ［3］袁阿兴，康书华，覃凌,等.斑纹芦荟的化学成分研究［j］.中草药，1994,25(7):339. ［4］高博，姚春所，周金云，等.木立芦荟中bace抑制活性成分的研究［j］.药学学报,2006,41(10):1000. ［5］yang xw ，gu zm ，ma cm ，et al.a new indole derivative isolated from the root of tuber fleeceflower (polygonum multiflorum )［j］. chin tradit herb drugs,1998,29(1):5. ［6］cui c b，yan s y，cai b，et al. carbazole alkaloids as new cell cycle inhibitors and apoptosis inducers from c lausenad unniana lev l ［j］. j asian nat prod res,2002, 4 (4):233. ［7］skehan p，storeng r，scudiero d, et al. new colorimetric cytotoxicity assay for anticancer drug screening ［j］. j natl cancer inst， 1990，82 (13):1107. ［8］pecere t,gazzola m v .aloe-emodin is a new type of anticance agent with selective activity against neuroectodermal tumors［j］.cancer research baltimore，2000，60(11):2800. ［9］张莉,宋冰冰.大黄素对肺癌细胞系a973增殖的影响［j］.实用肿瘤学杂志,2003,17(4):68.
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