涎腺腺样囊性癌（adenoid cystic carcinoma，ACC）是来自涎腺的上皮源性肿瘤，占涎腺恶性肿瘤的21.9%～24%。腺样囊性癌具有特殊的生物学行为，极易复发和远处转移，早期侵犯神经，并沿神经播散，而经区域淋巴道转移十分罕见[1]。ACC远处转移最常见的部位是肺、肝以及骨等。因此，ACC曾被描述为头颈部最具破坏性和不可预见性的肿瘤之一。近年来，癌细胞恶性演进过程中的分子机制及影响因素成为研究重点。ACC高转移株ACCM低表达细胞外基质相关分子（如Ⅳ型胶原蛋白、层黏连蛋白）及黏附相关分子（如钙黏着蛋白）。同时，ACCM高表达调控细胞外基质降解基因和细胞生长黏附与周期相关基因，前者如基质金属蛋白酶9（matrix me-talloproteinase 9，MMP9），后者如成纤维细胞生长因子7，即角质形成细胞生长因子（keratinocyte growth factor，KGF）[2]，其都与肿瘤的转移相关。升高的肿瘤内间质液压（interstitial fluid pressure，IFP）可以通过酸化周围环境、降低氧气含量、增加局部流体静脉压、调控基因表达等，促进肿瘤早期转移并成为治疗屏障[3-4]。研究表明，原发部位IFP升高可以促进肿瘤肺部及淋巴道转移[5]。升高的IFP可以通过pH值降低、组织缺氧等因素改变细胞微环境从而促进ACC细胞增殖，增强细胞侵袭能力，为腺样囊性癌的侵袭转移提供条件，但是造成生物学改变的具体机制尚不清楚[6]。本实验的目的是研究在增高的IFP作用下腺样囊性癌细胞基因表达及调控物质变化的特点，阐明IFP对腺样囊性癌侵袭[第一论文网专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临]能力增加的分子基础及其作用的分子机制。 1 材料和方法 1.1 试剂 ACC高转移株ACCM、低转移株ACC2由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供。Trizol试剂盒（Life Technologies公司，美国），逆转录试剂盒及实时荧光定量聚合酶链反应试剂盒（TaKaRa公司，日本），MMP9抗体、山羊抗兔二抗、辣根过氧化物酶复合物及显色剂DAB抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）抗体（Bioworld Technology公司，美国），磷酸化表皮生长因子受体（phospho-rylation epidermal growth factor receptor，P-EGFR）、磷酸化细胞外信号调节激酶（phosphorylation extra-cellular signal-regulated kinase，P-ERK）、KGF抗体（Abcam公司，美国）。过氧化物酶标记的二抗及增强化学发光底物（Millipore公司，美国）。 1.2 细胞培养 ACC细胞培养：在RPMI 1640、10%小牛血清、100 U·mL-1青霉素及100 μg·mL-1链霉素培养基中，于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育，细胞传代采用0.25%胰蛋白酶消化细胞。细胞生长至70%～80%用于后续实验。 1.3 实验分组 取对数期生长的ACC2接种于培养面积为25 cm2的细胞培养瓶中，设定压力强度为103.74 kPa，根据加压时间不同将实验组分为3 h组、6 h组、12 h组、24 h组。另外将加压培养的ACC2设置为阴性对照组，未加压培养的ACCM设置为阳性对照组。 1.4 免疫组织化学法半定量检测EGFR的表达 将密度为5×104个·mL-1的细胞悬液滴于爬片中央，待细胞贴壁后，在孔板内追加培养基，孵育过夜，于103.74 kPa加压3、6、12、24 h后，弃去细胞培养基，4%多聚甲醛固定15 min。所有的细胞爬片均按免疫ABC法进行检测。3%过氧化氢液37 ℃孵育20 min阻断内源性过氧化物酶；羊血清37 ℃封闭30 min；滴加EGFR抗体4 ℃过夜，次日37 ℃复温1 h；二抗37 ℃孵育30 min；辣根过氧化物酶复合物37 ℃ 30 min，DAB显示1 min。设立空白对照：兔血清代替一抗；阴性对照：PBS代替一抗。显微镜下细胞膜及细胞浆内出现棕色颗粒即为EGFR表达阳性。 1.5 逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptase poly-merase chain reaction，RT-PCR）法检测MMP9和EGFR mRNA的表达取各组细胞，以Trizol试剂盒方法提取总RNA，取等量RNA进行逆转录反应，合成cDNA，经Taq-DNA聚合酶作用扩增目标基因MMP9、EGFR、GAPDH。以GAPDH为内参，分析MMP9和EGFR基因的mRNA水平。以未加压组基因的表达量为基线，分析各处理组表达量的改变。MMP9引物序列：5’TCCAGTAGACAATCCTTGCAATGTG3’（正义链），5’CTC-CGTGATTCGAGAACTTCCAATA3’（反义链）；EGFR引物序列：5’GAGTAACAAGCTCACGCAG-TTG3’（正义链），5’GAGGAC ATAACCAGCCA-CCTC3’（反义链）；GAPDH引物序列：5’CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC3’（正义链），5’GTA-GAGGCAGGGATGATGTTCT3’（反义链）。 1.6 Western blot法检测相关蛋白表达 取对数期生长的细胞，以PBS清洗，加入细胞裂解混合液后，将细胞刮下，14 000 r·min-1离心15 min，取上清并[第一论文网专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临]行蛋白含量测定。加入等体积5×SDS-PAGE上样缓冲液，置沸水浴中加热10 min。样本在10% SDS-PAGE凝胶中电泳，电压100 V。电泳完成后湿转或半干PVDF膜上，再将此膜于4 ℃封闭过夜。次日按Western blot试剂盒说明书，利用抗人MMP9、EGFR、P-EGFR、KGF、P-ERK单抗进行抗原抗体结合反应和化学发光实验。 2 结果 2.1 加压环境对细胞内EGFR表达的影响 免疫组织化学检测结果表明：阴性对照组ACC2低表达EGFR，随着加压时间延长，实验组EGFR表达逐渐增加，整体呈时间正相关性，加压12 h后达到最大，与阳性对照组ACCM的表达接近（图1）。 Western blot检测结果表明：1）与阴性对照组相比，实验组EGFR的表达量在加压3 h后达到峰值，超过了阳性对照组中EGFR蛋白表达量，但是其蛋白表达量并未随着加压时间延长而逐步增加，在加压24 h后降至与阴性对照组相似水平。尽管EGFR的表达量未体现出明显的时间相关性，但在加压后，总蛋白的表达量仍有明显的上调。2）实验组P-EGFR的表达量呈时间正相关性，随着加压时间的延长，P-EGFR蛋白表达量逐渐增长，并在加压24 h后达到峰值，而阳性对照组及阴性对照组中P-EGFR均为低表达（图2）。 2.2 加压环境对MMP9和EGFR mRNA表达的影响 RT-PCR法检测结果表明：MMP-9和EGFR mRNA的表达量在加压6 h开始上调，在加压24 h达到最大，表达量整体表现出时间正相关性。MMP-9加压24 h后其表达量是阴性对照组的3.8倍，EGFR加压24 h其表达量是阴性对照组的4.5倍（图3）。 2.3 压力刺激对转移黏附相关蛋白的影响 Western blot检测结果表明：实验组随着加压时间的延长，MMP9、KGF、P-ERK蛋白的表达量均逐渐增加。MMP9及P-ERK的表达量在加压6 h后明显增加，加压24 h后略有降低；KGF的表达量与时间呈正相关，蛋白表达量在加压24 h后达到最大。阴性对照组的MMP9、KGF、P-ERK均低表达。 3 讨论 为了验证肿瘤微环境能与各种基因相互作用，本研究采用免疫组织化学技术半定量检测不同加压时间对EGFR表达的影响，结果显示ACC2细胞在间质液压升高的情况下上调EGFR表达量。为了更准确地证明间质液压的升高可以影响EGFR蛋白水平的表达，本研究还采用Western blot方法检测了EGFR及P-EGFR的表达情况，结果也证实了肿瘤微环境中间质液压与ACC2中蛋白表达改变的相关性。 MMP9与细胞侵袭迁移能力相关，且ACC细胞的侵袭性与加压时间呈正相关性[7]。本实验中检测了MMP9的mRNA及蛋白表达量，RT-PCR结果显示IFP的升高可从mRNA水平上调MMP9基因的表达，从而改变细胞的生物学行为，进一步证实了肿瘤微环境在肿瘤发生发展中的重要作用；然而蛋白水平的检测结果却是在加压环境中MMP9的蛋白表达量并未随时间延长而逐步增加，仅在加压6 h及12 h后出现了表达高峰。笔者推测，在ACC中可能还存在其他的与侵袭转移相关的分子。研究认为：P-ERK的上调与ACC肺转移存在密切关系[第一论文网专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临]，KGF是与腺样囊性癌密切相关的黏附相关分子，加之肿瘤微环境中IFP的升高也为肿瘤细胞转移提供了有利环境[4，8-9]。在本实验中笔者检测了加压环境中P-ERK及KGF在ACC中的表达情况。Western blot结果在一定程度上证实了这两种蛋白的表达量随着加压时间的延长而逐步增加。这就为加压环境中腺样囊性癌侵袭转移能力增加提供了分子基础。同时蛋白水平的检测也证实了EGFR及P-EGFR的表达量随着环境的改变而改变。这一结果表明肿瘤微环境可与肿瘤细胞相互作用，改变细胞的生物学行为。随着IFP的升高，细胞内与恶性表型相关的基因及蛋白表达量增加，为ACC2侵袭转移提供了分子基础。 IFP的升高与调控血管生成的基因相关，降低其表达或者改善间质流体动力学可早期降低IFP，从而利于常规放化疗的进行[4]。血管内皮生长因子（vas-cular endothelial growth factor，VEGF）、碳酸酐酶Ⅸ（carbonic anhydrase Ⅸ，CAⅨ）、丙酮酸脱氢酶激酶1等基因产物可改变血管的渗透性，降低间质液压，改善细胞外酸化和缺氧，从而克服肿瘤微环境成为治疗屏障这一问题[10]。趋化因子受体CXCR4与腺样囊性癌的组织学类型及转移潜能呈正相关性。在高压环境下黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）以及Src的激活有利于直肠癌细胞的黏附。那么IFP的升高会影响ACC细胞的黏附能力吗？能否解释ACC的极易复发、早期转移以及神经侵袭性的生物学行为呢？因此在今后的实验中，将继续检测与血管相关的分子（如血小板-内皮细胞黏附分子、VEGF-A、VEGF-C及组织纤维蛋白溶酶原激活剂以及Src等）在加压环境中表达量是否改变，进一步建立体内模型；并且，利用VEGF抑制剂、CAⅨ以及丙酮酸脱氢酶激酶1的基因产物来改善肿瘤微环境中升高的间质液压，观察ACC的生物学行为以及上述指标的表达情况，为肿瘤治疗提供理论依据。 综上所述，本实验表明，肿瘤微环境中间质液压的升高可从mRNA及蛋白水平两方面影响MMP9、KGF、P-ERK的表达，从而调控细胞的增殖、黏附、迁移和侵袭能力。 [参考文献] [1]Jaso J， Malhotra R. Adenoid cystic carcinoma[J]. Arch Pa-thol Lab Med， 2011， 135（4）：511-515. [2]Maruyama S， Cheng J， Yamazaki M， et al. Metastasis-asso-ciated genes in oral squamous cell carcinoma and salivary adenoid cystic carcinoma： a differential DNA chip analysis between metastatic and nonmetastatic cell systems[J]. Can-cer Genet Cytogenet， 2010， 196（1）：14-22. [3]Fukumura D， Jain RK. Tumor microvasculature and microen-vironment： targets for anti-angiogenesis and normalization [J]. Microvasc Res， 2007， 74（2/3）：72-84. [4]Lunt SJ， Fyles A， Hill RP， et al. Interstitial fluid pressure in tumors： therapeutic barrier and biomarker of angiogenesis [J]. Future Oncol， 2008， 4（6）：793-802. [5]Rofstad EK， Tunheim SH， Mathiesen B， et al. Pulmonary and lymph node metastasis is associated with primary tumor interstitial fluid pressure in human melanoma xenografts[J]. Cancer Res， 2002， 62（3）：661-664. [6]Diresta GR， Nathan SS， Manoso MW， et al. Cell prolifera-tion of cultured human cancer cells are affected by the ele-vated tumor pressures that exist in vivo[J]. Ann Biomed Eng， 2005， 33（9）：1270-1280.
本文选自《华西口腔医学杂志》2014年第2期，版权归原作者和期刊所有。
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