氯吡格雷（商品名波利维）一种临床常用的血小板聚集抑制剂，通过与血小板膜表面二磷酸腺苷（ADP）受体选择性的不可逆结合，继而抑制ADP介导的通路活化而发挥作用。氯吡格雷为药物前体，本身无活性，需被细胞色素P450（CYP）酶系转化为活性状态（clopidogrel）方可发挥作用，其中细胞色素P450 2C19（CYP2C19）的作用最重要[1]。CYP2C19酶由490个氨基酸组成，该酶在多种组织器官中均有分布，肝脏为主，参与多种药物的体内代谢[2]。CYP2C19基因多态性对CYP2C19酶活性起着决定性作用，基因多态性可影响对氯吡格雷活性的转化能力，从而对临床治疗效果产生影响，表现为药物疗效的个体差异[3]。研究表明，CYP2C19*1（野生型）、CYP2C19*2（无功能突变型）、CYP2C19*3（无功能突变型）为亚洲人群常见等位基因类型[4，5]。本研究目的是建立CYP2C19基因多态性的检测方法（ARMS PCR），并且以ADP诱导血小板聚集率分析CYP2C19基因多态性与氯吡格雷疗效的关系。 1 资料与方法 1.1 临床资料 我院2011年—2012年体检健康人群，无药物过敏史，检测CYP2C19基因型，选择CYP2C19*1/*1野生型10例，CYP2C19*2/*2 or*3突变型纯合子10例，CYP2C19*1/*2 or*3突变型杂合子10例。其中男18名，年龄21岁～34岁（28岁±4岁），女12名，年龄20岁～35岁（29岁±5岁）。研究对象受试前2周及受试期间禁烟、酒，并且不服用任何药物。 1.2 基因分型 利用ARMS PCR技术建立CYP2C19基因多态性检测方法，设计特异性引物和探针序列，引物和探针委托生工生物工程（上海）有限公司合成及纯化。样本处理：抽取受试者静脉血3 mL，EDTA抗凝，利用基因组提取试剂盒纯化核酸，基因组提取试剂盒购自北京天根生化公司，按照其说明书操作。Taq酶扩增系统购自上海Promega公司。反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃预变性15 s，60 ℃退火、延伸、信号采集40 s，40个循环。反应仪器：Mx3000荧光定量PCR仪，购自美国Agilent公司。基因分型结果由基因测序进行验证。 1.3 ADP诱导的血小板聚集率分析 受试者在第1天（300 mg）、第2天（75 mg）、第3天（75 mg）早饭前空腹服用氯吡格雷，并分别于首次服药前和服药后4 h采集静脉血3 mL，枸橼酸钠抗凝。氯吡格雷购自法国赛诺菲-圣德拉堡制药公司。采血后随即进行血小板聚集率分析。ADP购自美国Sigma公司，反应浓度为5 μmol/L，MPG-3型多功能血液凝聚仪购自上海斯隆医电公司。 1.4 统计学处理 使用SPSS 11.0软件对数据进行统计，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，同一基因型服药前后血小板聚集率比较采用配对t检验，不同基因型之间血小板聚集率比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 基因分型 采取受试者全血样本进行CYP2C19基因多态性分型，选择CYP2C19*1/*1野生型10例，CYP2C19*2/*2 or*3突变型纯合子10例，CYP2C19*1/*2 or*3突变型杂合子10例进行血小板聚集率分析研究。分型结果利用基因测序确认，二者一致。 2.2 ADP诱导的血小板聚集率分析 通过对受试者服药前后ADP诱导的血小板聚集率进行分析，3组CYP2C19基因型个体服药前ADP诱导的血小板聚集率差异无统计学意义（P>0.05），服药后3组个体均较服药前明显降低（P<0.01），其中CYP2C19*1/*1野生型组服药后聚集率明显低于CYP2C19*1/*2 or *3突变型杂合子和CYP2C19*2/*2 or*3突变型纯合子（P<0.05），CYP2C19*1/*2 or*3突变型杂合子与CYP2C19*2/*2 or*3突变型纯合子差异无统计学意义（P>0.05）。详见表1。 3 讨 论 氯吡格雷是一种常用的血小板聚集抑制剂，临床疗效显著，备受关注。氯吡格雷临床效果存在明显的个体差异，实验室检测ADP诱导的血小板聚集率降低不显著，未能达到预期的抗血小板作用，被称为“氯吡格雷抵抗（clopidogrel resistance，CR）”。国外研究约20%的用药者疗效不佳[6]。导致氯吡格雷临床效果个体差异的主要因素是CYP2C19基因多态性，该基因编码的酶作用于氯吡格雷前体的活性转化。其中CYP2C19*1/*1基因型转化效率最高（强度代谢，EM），CYP2C19*1/*2 or*3突变型杂合子次之（中度代谢，IM），CYP2C19*2/*2 or*3突变型纯合子最差（弱代谢，PM）。东亚人群弱代谢突变型分布频率（20%）远高于高加索人群（3%～5%）[7]。 基因多态性分析的方法有基因测序、限制性内切酶酶切片段长度多态分析法（RFLP）和ARMS PCR等。基因测序是基因分析的“金标准”，但操作复杂，仪器昂贵。限制性内切酶酶切片段长度多态分析法同样操作步骤多，易污染，灵敏度低。ARMS PCR操作简便、快捷，灵敏度高，对实验室要求较低，适合基层医院的使用。本研究基于ARMS PCR技术，建立了CYP2C19基因多态性分析方法。并且经基因测序验证，二者的检测结果完全一致。 ADP诱导的血小板聚集率分析结果显示，3组CYP2C19基因型个体服药前ADP诱导的血小板聚集率差异无统计学意义（P>0.05），服药后3组个体均较服药前明显降低（P<0.01），其中CYP2C19*1/*1野生型组服药后聚集率明显低于CYP2C19*1/*2 or*3突变型杂合子和CYP2C19*2/*2 or*3突变型纯合子（P<0.05），CYP2C19*1/*2 or*3突变型杂合子与CYP2C19*2/*2 or*3突变型纯合子差异无统计学意义（P>0.05）。CYP2C19*1/*1，CYP2C19*1/*2 or/*3，CYP2C19*2/*2 or*3基因型个体服用氯吡格雷的疗效逐步降低，进一步证明了遗传因素对药物效果的影响。 综上所述，本文建立了一种CYP2C19简便快捷的基因分型方法，进一步证实了CYP2C19基因型与氯吡格雷疗效个体化差异的关系，彰显了药物基因组学分析的重要性。通过对受试者基因分型检测，判定受试者的药物代谢速率类型，从而辅助医生合理调整药物剂量，提高药物的有效性，这也符合个体化医学发展的趋势。 参考文献： .Drug Metab Dispos，2010，38（1）：92-99. .N Engl J Med，2005，352（21）：2211-2221. [3] Damani SB，Topol case for routine genotyping in dual-antiplatelet therapy[J].J Am Coll Cardiol，2010，56（2）：109-111.
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