【摘要】 目的 探讨玉米须水提物对2型糖尿病大鼠胰岛β细胞功能的影响。方法 采用高脂高糖饲养加小剂量链脲佐菌素(stz)诱导模拟2型糖尿病雄性sd大鼠模型,给药干预8周后,分别测定各组大鼠空腹血糖(fbg)和空腹胰岛素(fins),用稳态模型评估(homa)方法评估homa-ir和homa-β,免疫组化法分析胰岛中胰岛素表达水平,并作he染色观察。结果 与模型组比较,中、高剂量的玉米须水提物可呈剂量依赖性降低糖尿病大鼠fbg和fins的水平(p<0.cn研究显示,长期持续高血糖可加重ir程度,也可直接损伤β细胞功能,导致血糖进一步升高,形成恶性循环[1]。目前多数实验着重于研究药物在糖代谢方面的作用机理,而对2型糖尿病胰岛β细胞保护作用的研究为数不多。本研究通过观察玉米须水提物对2型糖尿病大鼠胰岛β细胞的保护作用,旨在评价其对2型糖尿病ir和胰岛细胞分泌功能的影响,为进一步研究中草药降糖机制提供理论依据。
1 实验材料
1.1 动物
雄性清洁级sprague-dawley大鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号：scxk(京)2007-0001。
1.2 试剂和药物
链脲佐菌素(stz,美国sigma公司),兔抗大鼠胰岛素单克隆抗体(美国cst公司),两步法即用型试剂盒(天津灏洋公司),盐酸二甲双胍(上海衡山药业有限公司),血糖试纸(北京厚美德生物技术有限公司)等。玉米须水提物提取方法：干燥玉米须粉碎,称取200 g玉米须粉,用1.5 l蒸馏水,于50 ℃水浴振荡器中提取2遍,共3 h,尼龙布过滤收集滤液;将滤液离心取其上清液,于80 ℃水浴锅中浓缩至小体积后,用真空干燥器继续干燥,直至水分完全蒸发,即得玉米须水溶性提取物。实验时,蒸馏水溶解配制。
1.3 主要仪器
测力得血糖仪(台湾厚美德公司产品),7060全自动生化仪(日本日立公司产品),eclipse ti nikon倒置荧光显微镜(日本尼康公司),image-pro plus图像分析软件(media cybernetics公司)等。
2 实验方法
2.1 动物饲养及模型建立
雄性sprague-dawley大鼠80只,10～12周龄,体重(200±20)g,适应性喂养1周。将大鼠随机分为正常对照组(10只)和实验组(70只)。实验组大鼠喂以高脂高糖饲料(5 kg标准饲料加入1.5 kg白糖、2 kg猪油、1 kg奶粉、0.5 kg鸡蛋、0.3 kg食盐,其中蛋白质18%,脂肪32%,碳水化合物50%),直至实验结束。5周后,禁食10 h,给予腹腔注射在冰浴中新鲜配制的1%stz液30 mg/(kg·d),连续3 d,制备2型糖尿病大鼠模型;观察“三多一少”症状,并在72 h尾静脉采血测定空腹血糖(fbg),fbg≥16.7 mol/l且持续3 d保持不变者视为造模成功。正常对照组喂以标准饲料(蛋白质22%,脂肪18%,碳水化合物60%),直至实验结束。并在5周后连续3 d注射等体积的生理盐水[2-3]。
2.2 分组和给药
造模成功后将实验组大鼠随机分为5组,每组10只。模型对照组给予2 ml/d生理盐水灌胃;二甲双胍组给予200 mg/(kg·d)二甲双胍;玉米须水提物低、中、高剂量组分别给予150、300、600 mg/(kg·d)玉米须水提物灌胃。同
时正常对照组给予2 ml/d生理盐水灌胃。实验期间,模型对照组和玉米须水提物低剂量组大鼠分别死亡2只和1只。
2.3 指标检测
2.3.1 空腹血糖和空腹胰岛素水平测定 全自动生化仪测定fbg;放射免疫法测定血清胰岛素(fins)。
2.3.2 稳态模型公式 评估各组大鼠ir及胰岛β细胞分泌功能的变化：homa-ir=(fins×fbg)/22.5;homa-β=20×fins/(fbg-3.5)[4]。
2.3.3 胰岛的免疫组化检测分析 处死大鼠,分离胰腺,石蜡包埋,酒精脱水,5 μm连续切片及胰岛素(ins)免疫组化染色后,每组样本随机抽取切片各5张,光镜下(×40)每张切片选取10个视野,采用nikon倒置荧光显微镜进行拍照,应用image-pro plus图像分析软件分析ins表达的平均光密度、平均灰度及阳性细胞占总面积的百分比。
2.3.4 he染色 光镜下(×40)作胰岛组织形态学观察并用nikon倒置荧光显微镜进行拍照。
3 统计学方法
实验数据以x±s表示,因fins、homa-ir和homa-β为非正态分布,转化为自然对数后进行统计分析。所有数据均采用spss14.0统计软件anova进行处理分析,多组间比较采用单因素方差分析,2组间比较采用lsd-t检验。
4 结果
4.1 对糖尿病大鼠空腹血糖和空腹胰岛素的影响(见表1) 表1 各组大鼠fbg和fins的比较注：与模型对照组比较,*p<0.05,**p<0.01;与二甲双胍组比较,
△p<0.05,△△p<0.01(下同)
4.2 对糖尿病大鼠homa-ir和homa-β的影响(见表2) 表2 各组大鼠ir和胰岛β细胞分泌功能的比较(x±s)
4.3 胰岛组织形态学变化
正常对照组胰岛β细胞间界清楚,细胞形态规则,细胞核呈卵圆形,胰岛内各分泌细胞大小一致,核仁清晰,染色质均匀,淡染细胞颗粒,细胞呈索状排列;模型对照组胰岛数量减少,胰岛内细胞结构散乱,大部分细胞核淡染,溶解消失,胞浆出现空泡,不清晰;玉米须水提物低剂量组胰岛内细胞形态结构较模型组无明显改变;中剂量组胰岛内细胞形态结构较模型组规则,胞浆内空泡减少,核仁较清晰;高剂量组胰岛内分泌细胞形态、结构接近正常,胞浆均匀,少有空泡,核仁较清晰,细胞排列较均匀;二甲双胍组胰岛内细胞形态结构较正常,但细胞尚有肿胀现象。
4.4 胰岛免疫组化观察(见表3)表3 各组大鼠胰岛细胞中胰岛素表达情况的比较
5 讨论
ir和胰岛β细胞功能障碍是2型糖尿病发病的两个主要因素,ir是2型糖尿病发生的始动因素,而胰岛β细胞功能则是2型糖尿病是否发生的决定性因素。但二者之间的本质联系还不清楚。研究表明,高血糖发生前,ir可加重胰岛β细胞代偿负荷而损伤β细胞,引起血糖持续升高,最终导致糖尿病发生[5]。此外,持续高血糖不但是β细胞功能障碍所导致的后果,还进一步加重它的衰竭和ir。在早期2型糖尿病高血糖状态下,胰岛β细胞功能处于可逆状态,采用抑制β细胞分泌或代偿负荷使β细胞休息,降低高糖毒性,从而可恢复β细胞功能,减轻ir,以延缓糖尿病自然病程的进展,可使2型糖尿病回到更初期的阶段[6]。
玉米须为禾本科玉蜀黍属植物的干燥花丝和柱头,具有清热利尿、滋肾养阴、益气生津等功效。近年来,发现玉米须具有降糖、降压等药理作用,用于多饮、多尿、多食、消瘦、尿糖及血糖升高之气阴两虚型消渴症[7-8]。2型糖尿病属于中医“消渴”范畴。现代中医临床研究已表明,气阴两虚兼燥热血瘀是2型糖尿病的基本病机。到目前为止,滋阴益气法是临床治疗2型糖尿病的主要治法。因此,我们应用玉米须水提物对实验性2型糖尿病大鼠进行干预,以期明确其抗2型糖尿病的作用及其机制。
本研究结果表明,中、高剂量的玉米须水提取物可显著减低fbg和改善高胰岛素血症,效果与二甲双胍作用相当(p>0.05)。有报道,玉米须降糖作用可能与其修复胰腺细胞受损的作用有关[9]。但是,针对玉米须是否刺激胰岛素分泌而改善β细胞分泌功能的研究鲜有报道。我们应用homa模式评价ir和胰岛β细胞分泌功能,结果显示,中、高剂量玉米须水提物可明显降低homa-ir,显著提高homa-β细胞分泌指数,提示玉米须水提物可能通过减轻ir和改善胰岛β细胞功能而使血糖下降。我们进一步进行了胰岛组织形态学观察和胰岛素的免疫组织化学分析,结果显示,中、高剂量的玉米须水提物能显著增强胰岛细胞中胰岛素表达,同时也改善了胰岛内分泌细胞结构和形态。因此,我们推测玉米须水提物可能通过降低血糖、减轻ir、促进损伤的胰岛β细胞修复而改善胰岛β细胞功能。
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