细胞的防御机制(α防御素的作用机制)

作者：李明，陈伟强，李岩，罗少洪，简玲敏

【摘要】 目的 研究含cpg基序的寡核苷酸(unmethylated cpg motif containing　oligodeoxynucleotide，cpg odn)对人肺腺上皮细胞a549 β防御素2(human βdefensin 2,hbd2)的表达及p38 mapk磷酸化水平的影响。方法 培养a549细胞，加或不加p38特异性抑制剂sb203580情况下用不同浓度cpg odn进行干预。用rtpcr法检测刺激后a549细胞hbd2 mrna表达变化，用western blot法检测细胞内p38 mapk蛋白磷酸化水平的变化。结果 cpg odn刺激可以促进a549细胞内磷酸化p38 mapk含量的增加，活化p38 mapk途径，从而诱导hbd2的表达，与对照组比较,p<0.05;用特异性阻断剂sb203580阻断p38 mapk磷酸化可抑制cpg odn的诱导作用。结论 cpg odn通过p38 mapk途径诱导hbd2在呼吸道上皮细胞的表达，增强呼吸道对外界微生物的抵抗作用。

【关键词】 cpg odn; β防御素2;肺腺上皮细胞;p38 mapk

　abstract:objective to investigate the effects of unmethylated cpg motif containing　oligodeoxynucleotide (cpg odn) on the expression of human βdefensin 2 (hbd2) and the phosphorylation of p38 mapk in lung epithelial cell line a549. methods a549 cells were stimulated with cpg odn at different concentrations in the presence or absence of sb203580,an inhibitor of p38 mapk. the mrna expression of hbd2 was determined by rtpcr and the phosphorylation level of p38 mapk was detected by western blot. results cpg ond significantly enhanced the expression of hbd2 in a549 cells. the phosphorylation level of p38 mapk was markedly upregulated. cpg odninduced hbd2 expression was suppressed by inhibition of p38 mapk by sb203580. conclusion cpg odn might effectively upregulate hbd2 expression in lung epithelial cells through p38 mapk pathway.

　　key words:cpg odn;human βdefensin 2;lung epithelial cells;p38 mapk

　　 目前认为，呼吸道上皮细胞不仅是物理性的防御屏障，还可以合成和分泌包括抗菌肽在内的多种细胞因子，在气道的炎症反应、免疫调节等方面发挥重要作用。β防御素2(human βdefensin 2,hbd2)是呼吸道上皮细胞在细菌和炎症因子诱导下所分泌的主要抗菌肽分子，不仅具有抗菌、抗病毒等生物学活性，还可以激活获得性免疫系统，在呼吸系统抵抗外界致病微生物感染中起重要作用[1]。如果能增强呼吸道hbd2的表达，对于防治呼吸系统的感染性疾病和应对日益严重的细菌耐药具有重要意义。细菌dna与真核细胞不同，其含有大量的以非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(cytosine phosphateguanosine，cpg) 为核心的特定序列(即cpg基序)，因此可被真核细胞通过tlr9识别，最终激活nfκb、p38 mapk等信号分子启动免疫应答[2,3]。目前人工合成的含cpg基序的寡核苷酸序列(unmethylated cpg motif containing　oligodeoxynucleotide，cpg odn)已成为一种具有非特异性免疫刺激能力的免疫佐剂，能有效诱导t、b淋巴细胞活化和抗原提呈细胞成熟，增强机体免疫反应。本研究用cpg odn刺激肺腺上皮细胞a549，观察其对hbd2表达的影响，并从p38 mapk信号途径出发探讨其作用机制，探索cpg odn作为免疫佐剂对呼吸道天然免疫分子hbd2的诱导作用。

　 　1 材料

　　1.1 主要试剂 cpg odn 1826、引物(大连takara公司);两步法rtpcr试剂盒、trizol (美国invitrogen 公司); sb203580(美国sigma公司);蛋白提取试剂盒、ecl化学发光试剂盒(美国pierce公司);抗p38 mapk、磷酸化p38 mapk抗体(美国santa cruze公司)。

　　1.2 主要仪器 pcr仪(美国perkinelmer公司);紫外凝胶成像系统、蛋白电泳仪、电转仪、杂交箱(美国biorad公司)。

　 　2 方法

　　2.1 细胞培养及干预实验 人肺腺上皮细胞a549为本室保存，用完全dmem培养基传代培养。生长状态良好的a549细胞经0.25%(φ)胰酶消化后，调整细胞浓度为5×105/ml，1 ml每孔接种到6孔培养板内，待细胞生长至80%融合后，用pbs清洗2次，更换培养液，加入不同浓度的cpg odn [4](碱基序列为5′tccatgacgttcctgacgtt3′，所有碱基均经硫代磷酸化修饰，终质量浓度分别为1,10,50 mg/l),或先加入p38 mapk特异性抑制剂sb203580(终质量浓度50 μmol/l)孵育1 h后再加入cpg odn进行刺激。实验分组如下：(1)对照组;(2)cpg odn 1 mg/l组;(3)cpg odn 10 mg/l组;(4)cpg odn 50 mg/l 组;(5)cpg odn 50 mg/l+sb203580组。根据实验要求在相应时间点取细胞进行后继实验。

　　2.2 hbd2 mrna表达的测定 各组细胞加入cpg odn后继续培养8 h，用trizol法提取细胞总rna，用紫外分光光度计测定a260/a280为1.8～2.0，证实rna 纯度符合rtpcr 反应要求。以总rna为模板，以oligod(t)18为引物逆转录合成第一链cdna，用特异性引物扩增hbd2和β actin。hbd2引物序列如下：sense：5′ gcc　tct　tcc　agg　tgt　ttt　tg3′，antisense：5′ gag　acc　aca　ggt　gcc　aat　tt 3′;βactin引物序列如下：sense：5′ agc ctc gcc ttt gcc ga 3′，antisense：5′ ctg gtg cct ggg gcg 3′。pcr条件为94 ℃预变性4 min，然后94 ℃变性30 s，58 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，共循环30次，最后72 ℃延伸5 min。1.5%琼脂糖电泳pcr产物，用qautity one软件分析目的基因与内参βactin基因的pcr产物灰度值，以二者比值来表示目的基因mrna的相对表达量。

　　2.3 p38 mapk蛋白磷酸化表达水平的测定 a549细胞加入刺激物后继续培养0.5 h，以冰冷的pbs终止刺激，按照试剂盒操作步骤提取细胞总蛋白，bca法测定蛋白浓度。取20 μg样品煮沸变性后进行sdspage电泳(5%的浓缩胶和10%的分离胶)，转膜，5%的脱脂奶粉37 ℃封闭1 h，加抗p38 mapk或磷酸化p38 mapk(1∶1 000)单克隆抗体，4 ℃孵育过夜，洗膜，加辣根过氧化物酶标记的二抗稀释液(1∶2 000) 37 ℃孵育1 h，ecl法显影，用磷酸化p38 mapk与p38 mapk二者灰度比值来表示磷酸化水平的变化量。

　　2.4 统计分析 所有数据以(±s)表示，采用spss 11.0统计软件对实验结果进行student′s t检验分析，p<0.05 为有统计学意义。

　 　3 结果

　　3.1 cpg odn对hbd2 表达的影响 通过rtpcr检测发现，在无外源性刺激的情况下肺腺上皮a549细胞hbd2基因表达极低，用不同浓度的cpg odn刺激后，hbd2 mrna表达亦随之增多，在1～50 mg/l范围内呈剂量依赖性。而用p38 mapk特异性抑制剂sb203580预处理抑制了cpg odn诱导的hbd2表达，提示cpg odn的诱导作用与其激活p38 mapk信号途径有关。见图1。

　　2 pcr产物凝胶电泳图; 2相对表达量(% of hbd2/βactin); 1. 对照组; 2. cpg odn 1mg/l组; 3. cpg odn 10 mg/l组; 4. cpg odn 50 mg/l组;

　　5. sb203580+ cpg odn 50 mg/l组

　　与对照组比较：*p<0.05，**p<0.01

　　图1 cpg odn上调a549细胞hbd2 mrna表达

　　figure 1 upregulate hbd2 mrna expression in cpg odnstimulated a549 cells (n=3)

　　3.2 cpg odn对p38 mapk蛋白磷酸化水平的影响 western blot结果显示，在正常a549细胞内处于活化状态的磷酸化p38 mapk含量较少，在1～50 mg/l浓度范围内用cpg odn刺激后细胞内磷酸化p38 mapk含量明显增加(与对照组比较,p<0.05)，说明cpg odn刺激导致p38 mapk被磷酸化激活，且其磷酸化水平与cpg odn剂量呈依赖性关系。见图2。

　　a. p38 mapk western杂交图; b. p38 mapk相对磷酸化强度 (% of p p38 mapk /tp38 mapk); 1. 对照组; 2. cpg odn 1 mg/l组; 3. cpg odn 10 mg/l组; 4. cpg odn 50 mg/l组

　 　4 讨论

　　tokunaga等于1984年率先发现细菌dna除了是一种遗传物质外，还具有免疫刺激的特性[5]。krieg等证实，细菌核酸中的免疫刺激活性成分是一些含有非甲基化cpg为基序的特定序列，称为cpg基序[6]。在脊椎动物细胞中，cpg基序出现的频度很低，且80%以上为甲基化，因此非甲基化cpg基序为细菌等原核细胞所特有，是细菌dna诱导机体产生保护性免疫反应的基础。大量研究证实，模拟细菌dna结构人工合成的cpg odn可以活化多种免疫细胞，包括t、b淋巴细胞、单核/巨噬细胞、nk细胞和树突状细胞等，同时诱导分泌多种细胞因子，如il6、il12、tnfα、ifnβ等，可显著增强机体的先天性免疫和获得性免疫应答，被认为是一种具有潜力的新型免疫佐剂[2-4,6]。cpg odn进入细胞后通过与胞内的tlr9分子结合，一方面可以通过降解iκb导致nfκb信号途径活化，一方面可以通过mapkkk1导致p38 mapk被磷酸化激活，从而引起机体的免疫应答。

　　hbd2是黏膜和上皮细胞抵抗微生物入侵的重要介质，在持续暴露于病原微生物的器官表面(如呼吸系统、消化系统、皮肤)发挥重要的抗菌作用。研究证实，特应性皮炎和肺腺囊化病患者容易发生反复感染与其hbd2表达或功能受损密切相关[7]，而寻常性银屑病患者皮损部位由于hbd2表达增高所以不易发生感染[8]。hbd2在上皮细胞呈诱导性表达，在肺部炎症患者的肺泡灌洗液或血浆中发现hbd2蛋白增高[9]。同时，hbd2还可以通过趋化因子ccr6诱导未成熟树突状细胞和记忆性t淋巴细胞向炎症局部迁移，从而提高呼吸道的获得性免疫反应[1]。因此，研究如何诱导呼吸系统hbd2表达对提高呼吸道抵御致病微生物，防治呼吸系统感染性疾病具有重要意义。本研究以人肺腺上皮细胞a549为研究对象，用cpg odn进行刺激，结果表明cpg odn作为一种非特异性黏膜免疫刺激剂，能显著提高呼吸道上皮细胞hbd2的表达。cpg odn在实验所使用的剂量范围内呈剂量依赖性诱导hbd2表达，高剂量的cpg odn诱导效果更强。对hbd2表达调控的研究发现，hbd2的表达与p38 mapk、pkc及nfκb等信号分子活化有关[1,10]，cpg odn可以通过tlr9途径激活p38 mapk信号分子，因此本课题从p38 mapk入手，观察其磷酸化水平的变化，对cpg odn诱导hbd2表达的信号通路进行了初步探讨。实验结果显示cpg odn刺激肺腺上皮细胞a549可以导致p38 mapk磷酸化水平增高，用特异性p38 mapk抑制剂sb203580预处理能明显抑制cpg odn诱导的hbd2表达。提示cpg odn诱导hbd2表达与p38 mapk信号分子活化密切相关。当然，hbd2的诱导表达是通过多信号途径实现的，是否还有其他信号途径参与了cpg odn诱导的hbd2表达尚待进一步研究。

　　综上所述，本研究表明,cpg odn可通过激活p38 mapk信号途径诱导抗菌分子hbd2在呼吸道上皮细胞中的表达，为进一步研究利用免疫增强剂诱导呼吸道hbd2表达，增强呼吸道抗微生物能力和防治呼吸系统感染性疾病打下基础。

【 参考 文献 】
　[1] laube d m,yim s,ryan l k,et al. antimicrobial peptides in the airway [j]. curr top microbiol immunol,2006,306:153-182.

　　[2] mutwiri g,van drunen littelvan den hurk s,babiuk l a. approaches to enhancing immune responses stimulated by cpg oligodeoxynucleotides [j]. adv drug deliv rev,2009,61(3):226-232.

　　[3] verthelyi d,klinman d m. immunoregulatory activity of cpg oligonucleotides in humans and nonhuman primates [j]. clin immunol,2003,109 (1) : 64-71.

　　[4] 李岩,邢飞跃,李明. cpg odn 对树突状细胞抗肝癌作用的影响[j].