毛细管电泳法测定栀子金花丸中黄芩苷的含量

作者：杨慧文，王晓可，毋福海

【摘要】 目的 建立栀子金花丸中黄芩苷的含量测定方法。方法 采用未涂层弹性融硅石英毛细管柱(60 cm× 75 μm，有效长度52 cm)，以40 mmol·l-1硼砂溶液(ph9.0)为运行缓冲液;分离电压为12 kv;重力进样10 s(高度15 cm);检测波长为280 nm;以对硝基苯甲酸为内标。结果 黄芩苷质量浓度在7.5～52.5 μg·ml-1范围内具有良好的线性关系(r=0.999 6)，黄芩苷平均回收率为96.7%，rsd值为1.62%(n=6)。结论 该方法专属性强，结果准确可靠、重现性好，可用于栀子金花丸的质量控制。

【关键词】 毛细管电泳法;栀子金花丸;黄芩苷

　　abstract:objective to establish the method for the determination of baicalin in zhizijinhua pills by capillary electrophoresis. methods the separation was performed in an uncoated fused silica capillary of 60 cm×75 μm id (52 cm effective length).the running buffer wes 40 mmol·l-1 na2b4o7 buffer solution(ph9.0).the voltage applied was 12 kv. the sample was injected by gravity(10 s，15 cm). the detection wavelength was 280 nm,and the internal standard was pnitrobenzoic acid. results the linear range of baicalin was 7.5-52.5 μg·ml-1(r=0.999 6). the average recovery for baicalin was 96.7%(rsd=1.62%,n=6). conclusion the method proved to be exclusive,convenient,rapid and well repeatable，and can be used for quantitative determination of zhizijinhua pills.

　　key words:capillary electrophoresis;zhizijinhua pills;baicalin

　栀子金花丸是由栀子、黄芩、黄连、黄柏等8味药材制成的中药成方制剂，具有清热泻火、凉血解毒之功效。临床用于肺胃热盛，口舌生疮，牙龈肿痛，目赤眩晕，咽喉肿痛，吐血衄血，大便秘结等的 治疗 。栀子金花丸的现行标准采用hplc法测定制剂中栀子苷的含量[1]，亦有其他 文献 报道采用hplc法测定其中黄芩苷、栀子苷、绿原酸等成分的含量 [2～6]，但采用毛细管电泳法对栀子金花丸进行质量控制的方法尚未见报道。本文采用毛细管电泳法测定栀子金花丸中黄芩苷的含量，为更好地控制栀子金花丸质量提供了依据。

　　1 仪器与试药

　　1.1 仪器

　　cl1030型高效毛细管电泳仪(北京彩陆 科学 仪器有限公司)，knauer k2501紫外-可见检测器(德国)，hw2000色谱工作站2.17版(南京千谱软件有限公司)。orion model 828型ph计(美国)。dl360超声波清洗器[宁波石浦海天 电子 仪器厂，频率(4.5±0.225)khz，功率240 w]。未涂层弹性融硅石英毛细管柱(河北锐年永沣色谱器件有限公司)。

　　1.2 试药

　　黄芩苷( 中国 药品生物制品检定所，批号110715-200815)。栀子金花丸(山东孔圣堂制药有限公司，批号090457、090546、090741，规格 9 g·袋-1)。甲醇为色谱纯;硼砂、对硝基苯甲酸、naoh均为分析纯;水为双蒸水。

　　2 方法与结果

　　2.1 溶液的制备

　　2.1.1 内标溶液的制备 精密称取对硝基苯甲酸适量，加水制成100 μg·ml-1的内标贮备液。

　　2.1.2 对照品贮备液的制备 精密称取在60 ℃减压干燥4 h的黄芩苷对照品15 mg，置100 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液(黄芩苷质量浓度为150 μg·ml-1)。

　　2.1.3 供试品溶液的制备 取栀子金花丸样品，研碎，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%(体积分数)甲醇50 ml，称定重量，超声处理40 min，放冷，再称定重量，用70%(体积分数)甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液10 ml至蒸发皿中，水浴挥干，再用70%(体积分数)甲醇溶解转移至10 ml量瓶中，加入内标溶液2.5 ml，用70%(体积分数)甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

　　2.1.4 阴性对照液的制备 取处方组成中除黄芩外的其余药材，制成不含黄芩的阴性对照品，按“2.1.3”项下方法处理，即得。

　　2.1.5 运行缓冲液的制备 精密称取硼砂适量，加水制成40 mmol·l-1硼砂溶液(ph=9.0)，0.45 μm微孔滤膜滤过，作为运行缓冲液。

　　2.2 电泳条件

　　采用未涂层弹性融硅石英毛细管柱(60 cm×75 μm，有效长度52 cm);以40 mmol·l-1硼砂溶液(ph9.0)为运行缓冲液;分离电压为12 kv;重力进样10 s(高度15 cm);检测波长为280 nm;温度为室温，湿度小于70%。毛细管柱在使用前依次用0.1 mol·l-1 naoh溶液和水冲洗15～20 min，再用运行缓冲液冲洗约5 min。以对硝基苯甲酸为内标。在此条件下进行测定，对照品、供试品、阴性对照溶液色谱图见图1。

　　2.3 方法学考察

　　2.3.1 标准曲线的制备 分别吸取对照品贮备液适量，加甲醇稀释成黄芩苷质量浓度为7.5、15.0、22.5、30.0、37.5、45.0、52.5 μg·ml-1，内标物质量浓度为25.0 μg·ml-1的溶液。依次重力进样10 s，每个浓度测定3次以上。以对照品与内标峰面积的比值为纵坐标(y)，黄芩苷质量浓度(ρ)为横坐标进行线性回归，得回归方程y=0.0350ρ-0.0383，r=0.999 6。表明黄芩苷在7.5～52.5 μg·ml-1范围内线性关系良好。

　　2.3.2 精密度试验 取质量浓度为30.0 g·ml-1的黄芩苷对照品溶液，按“2.2”项下电泳条件，连续测定5次，记录峰面积并 计算 rsd值。结果黄芩苷峰面积的rsd=1.99%，表明仪器精密度良好。

　　2.3.3 稳定性试验 取供试品溶液(批号090741)，在0、2、4、6、8、12 h分别重力进样10 s，记录峰面积并计算rsd。结果黄芩苷峰面积的rsd=1.65%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

　　2.3.4 重复性试验 取同一批号(批号090741)的栀子金花丸样品6份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，依法测定。结果栀子金花丸中黄芩苷的平均含量为1.63 mg·g-1，rsd=1.62%(n=6)。表明重复性良好。

　　2.3.5 加样回收率试验 精密称取栀子金花丸样品(批号090741)共6份，加入黄芩苷对照品适量，按“2.1.3”项下方法处理并依法测定，计算回收率，结果见表1。栀子金花丸中黄芩苷的平均回收率为96.7%,rsd=2.15%。表1 加样回收率试验

　　2.4 样品测定

　　取栀子金花丸样品3批，按“2.1.3”项下方法处理后依法测定，记录峰面积，代入回归方程计算样品中黄芩苷的含量，结果见表2。表2 样品含量测定

　　3 讨论

　　3.1 提取方法的选择 参考 有关文献[7，8]中黄芩苷的提取方法，本实验先后以50%(体积分数)甲醇、70%(体积分数)甲醇、甲醇为溶剂进行超声提取。结果表明，样品采用70%(体积分数)甲醇超声提取基本完全，且黄芩苷与杂质峰分离度较好。同时考察了不同提取时间(30、40、50 min)对提取效率的影响，结果显示超声40 min时提取率已达最高，超声时间延长而提取率并未提高。因此，确定以70%(体积分数)甲醇为提取溶剂，超声提取40 min。

　　3.2 内标物的选择 毛细管电泳有重现性差的缺点，因此采用内标法定量。苯甲酸钠、对氨基苯甲酸以及对硝基苯甲酸在280 nm波长处均有吸收。预实验结果表明，苯甲酸钠在体系中不出峰;对氨基苯甲酸灵敏度低，且出峰时间与黄芩苷过于接近，容易产生干扰;对硝基苯甲酸峰型好，虽出峰时间与黄芩苷接近，但在样品中无干扰，故选其作为内标物。

　　3.3 运行缓冲液的选择[9] 黄芩苷极性较强，容易离子化;而在硼砂溶液中，黄芩苷中邻二羟基基团更易形成络离子[10]，加快离子化。因此选择硼砂溶液为运行缓冲液，并通过实验确定其最佳浓度为40 mmol·l-1。

　　3.4 采用毛细管电泳法测定栀子金花丸中黄芩苷含量，与高效液相色谱法相比[1，5，6]具有样品用量少，分析成本低等优点，并减少了对环境的污染，可用于栀子金花丸的质量控制。

【参考文献】
　[1] 国药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部[m].北京：

　　2.3 方法学考察

　　2.3.1 标准曲线的制备 分别吸取对照品贮备液适量，加甲醇稀释成黄芩苷质量浓度为7.5、15.0、22.5、30.0、37.5、45.0、52.5 μg·ml-1，内标物质量浓度为25.0 μg·ml-1的溶液。依次重力进样10 s，每个浓度测定3次以上。以对照品与内标峰面积的比值为纵坐标(y)，黄芩苷质量浓度(ρ)为横坐标进行线性回归，得回归方程y=0.0350ρ-0.0383，r=0.999 6。表明黄芩苷在7.5～52.5 μg·ml-1范围内线性关系良好。

　　2.3.2 精密度试验 取质量浓度为30.0 g·ml-1的黄芩苷对照品溶液，按“2.2”项下电泳条件，连续测定5次，记录峰面积并 计算 rsd值。结果黄芩苷峰面积的rsd=1.99%，表明仪器精密度良好。

　　2.3.3 稳定性试验 取供试品溶液(批号090741)，在0、2、4、6、8、12 h分别重力进样10 s，记录峰面积并计算rsd。结果黄芩苷峰面积的rsd=1.65%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

　　2.3.4 重复性试验 取同一批号(批号090741)的栀子金花丸样品6份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，依法测定。结果栀子金花丸中黄芩苷的平均含量为1.63 mg·g-1，rsd=1.62%(n=6)。表明重复性良好。

　　2.3.5 加样回收率试验 精密称取栀子金花丸样品(批号090741)共6份，加入黄芩苷对照品适量，按“2.1.3”项下方法处理并依法测定，计算回收率，结果见表1。栀子金花丸中黄芩苷的平均回收率为96.7%,rsd=2.15%。表1 加样回收率试验

　　2.4 样品测定

　　取栀子金花丸样品3批，按“2.1.3”项下方法处理后依法测定，记录峰面积，代入回归方程计算样品中黄芩苷的含量，结果见表2。表2 样品含量测定

　　3 讨论

　　3.1 提取方法的选择 参考 有关 文献 [7，8]中黄芩苷的提取方法，本实验先后以50%(体积分数)甲醇、70%(体积分数)甲醇、甲醇为溶剂进行超声提取。结果表明，样品采用70%(体积分数)甲醇超声提取基本完全，且黄芩苷与杂质峰分离度较好。同时考察了不同提取时间(30、40、50 min)对提取效率的影响，结果显示超声40 min时提取率已达最高，超声时间延长而提取率并未提高。因此，确定以70%(体积分数)甲醇为提取溶剂，超声提取40 min。

　　3.2 内标物的选择 毛细管电泳有重现性差的缺点，因此采用内标法定量。苯甲酸钠、对氨基苯甲酸以及对硝基苯甲酸在280 nm波长处均有吸收。预实验结果表明，苯甲酸钠在体系中不出峰;对氨基苯甲酸灵敏度低，且出峰时间与黄芩苷过于接近，容易产生干扰;对硝基苯甲酸峰型好，虽出峰时间与黄芩苷接近，但在样品中无干扰，故选其作为内标物。

　　3.3 运行缓冲液的选择[9] 黄芩苷极性较强，容易离子化;而在硼砂溶液中，黄芩苷中邻二羟基基团更易形成络离子[10]，加快离子化。因此选择硼砂溶液为运行缓冲液，并通过实验确定其最佳浓度为40 mmol·l-1。

　　3.4 采用毛细管电泳法测定栀子金花丸中黄芩苷含量，与高效液相色谱法相比[1，5，6]具有样品用量少，分析成本低等优点，并减少了对环境的污染，可用于栀子金花丸的质量控制。

【参考文献】
　[1] 国药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部[m].北京：