辛伐他汀对γ诱导的人外周血单个核细胞

中国论文网为大家解读本文的相关内容： 【摘要】目的：探讨经IFNγ刺激后，人外周血单个核细胞表达CD40的变化，以及经辛伐他汀干预后不同基因型单个核细胞表达CD40的影响。方法：随机选择42例健康志愿者，密度梯度离心法分离外周血单个核细胞并原代培养，用100 μg/L IFNγ及20 μmol/L辛伐他汀对单个核细胞进行干预，流式细胞术检测单个核细胞培养24 h后表达CD40的水平。聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCRRFLP)检测这42位志愿者CD401C/T基因多态性，分析不同基因型个体外周血单个核细胞表达CD40的水平。结果：基础状态下单个核细胞培养24 h后，CD40表达水平升高，且CC、CT、TT基因型单个核细胞CD40表达水平无显著差异(P>0.05);IFNγ刺激状态下，单个核细胞CD40表达水平显著升高，且CC基因型升高的幅度显著高于CT、TT基因型(P<0.05);辛伐他汀和IFNγ共同作用下，辛伐他汀可显著抑制IFNγ诱导的CD40表达，但对CC、CT、TT基因型单个核细胞的抑制率没有统计学意义(P>0.05)。结论：CD401C/T多态性可以影响单个核细胞CD40表达水平，辛伐他汀可显著抑制IFNγ刺激后CD40的表达，但对不同基因型单个核细胞的保护作用无显著性差异。

　　【关键词】 辛伐他汀;CD40;IFNγ;单个核细胞;急性冠状动脉综合征

　　Effects of Simvastatin on Expression of CD40 in Peripheral Blood Mononuclear Cells Induced with IFNγ　TIAN Caixia1,QIN Weichao1,WANG Jianing2,QIU Fangcheng1,LIU Tangxin3*(1Department of Clinical Laboratory,Renmin Hospital,2Institute of Clinical Medcine,Renmin Hospital,3Department of Orthopedics,Taihe Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China)

　　Abstract:Objective To explore the change of CD40 expression in peripheral blood mononuclear cells(PBMNC) with induction of IFNγ,and the effects of simvastatin on expression of CD40 induced with IFNγ in PBMNCs with different s Fortytwo healthy volunteers were enrolled,PBMNCs were separated from heparinized venous blood by density gradient centrifugation and then cultured with 100 μg/L IFNγ or 20 μmol/L simvastatin for 24 CD40 expression level was determined by flow pes of the CD401C/T were assayed by polymerase chain reactionrestricted fragment length polymorphism(PCRRFLP).The expression levels of CD40 in PBMNC with different genotypes were s The levels of CD40 expression without intervention was increased after 24 h,however,there was no significant difference among CC,CT and TT genotypes (P>0.05).The levels of CD40 expression in PBMNC in all genotypes were increased significantly after induction with IFNγ and culture for 24 h,and the increase extent of CC genotype was significant higher than that of the other genotypes(P<0.05).Simvastatin could significantly inhibited the expression of CD40 in PBMNC induced with IFNγ,while the inhibitory effects of Simvastatin had no significant difference among different sion CD401C/T polymorphism could influence the CD40 expression of PBMNC,Simvastatin could markedly inhibit the expression of CD40 in PBMNCs induced with IFNγ,but there was no significant difference in the protective effects of Simvastatin among different genotypes of PBMNCs.

　　Key words:Simvastatin;CD40;IFNγ;Mononuclear cell;Acute coronary syndrome

　　最近的研究[1]发现，他汀类药物除具有调脂作用外，还具有抗炎症反应作用。CD40属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，具有所有炎性因子的共同特征。药物基因组学研究认为[2]，基因表型与药物疗效之间存在着明显关系。辛伐他汀是否影响CD40的表达及对不同基因表型个体的抗炎效应是否相同还不清楚。本文探讨经干扰素γ(IFNγ)干预后，辛伐他汀对CD40表达的调节作用，并进一步探讨其对携带CD40不同基因表型的单个核细胞表达CD40的影响。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　随机选择郧阳医学院附属人民医院体检保健科的健康志愿者42例，均经体检及实验室检查排除任何感染症状和炎症状态，平均年龄(25.43±3.15)岁，其中男30例，女12例。

　　1.2 外周血单个核细胞的分离及培养

　　采集健康志愿者外周静脉血16 mL，EDTANa2抗凝，用PBS缓冲液1∶1稀释，轻轻颠倒试管混匀。用尖头吸管将稀释血轻轻平铺于离心管内的淋巴细胞分离液表面(比重1.007)，稀释血与淋巴细胞分离液体积比为2∶1，可见二者间形成清晰界面，室温下水平式离心机2 000 r/min离心20 min，离心后单个核淋巴细胞呈白膜状悬于分离液层与红细胞层之间，用尖头吸管小心吸取单个核淋巴细胞层至新的离心管，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液洗涤2次(室温下水平式离心机1 500 r/min离心10 min)，将清洗后的细胞重悬于RPMI 1640培养液中(含10%胎牛血清、1 nmol/L谷氨酰胺、105U/L青链霉素)，取0.1 mL，台盼兰染色，显微镜下计数活细胞比率，要求>95%。

　　将细胞接种于培养皿中，置于37 ℃ 5%CO2培养箱孵育2 h后，吸出培养液，用37 ℃预热的新鲜培养液清洗3次，洗脱未贴壁细胞，贴壁细胞即主要为单核细胞。瑞氏染色鉴定贴壁细胞中单核细胞比率占85%以上。将贴壁细胞用细胞刮片轻轻刮下，重悬于RPMI 1640培养液中，调整细胞浓度为1×106/mL，并接种于24孔培养板，2 mL/孔。

　　1.3研究对象CD401C/T单核苷酸多态性基因分型

　　改良的碘化钠法提取模板DNA，聚合酶链反应扩增包含1C/T位点的特异性片段，扩增产物用5U限制性内切酶NcoⅠ酶切，37 ℃反应6 h，反应终止后，消化片段用2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶(EB)染色，紫外灯下观察。

　　1.4实验分组

　　给予100 μg/L IFNγ干预作为刺激状态组，以20 μmol/L辛伐他汀先与单个核细胞共孵育1 h，再给予100 μg/L IFNγ刺激为辛伐他汀干预组，24 h后用流式细胞仪检测培养的单个核细胞表面CD40的表达水平。

　　1.5统计学分析

　　计量资料用x±s表示，两样本之间计量资料比较用两独立样本t检验，多样本之间计量资料比较用单因素方差分析，所有数据均在SPSS11.5软件包上分析，P<0.05为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 研究对象基本资料

　　42例研究对象按照CD401C/T位点基因型分为CC基因型(13例)，CT基因型(24例)和TT基因型(5例)。研究对象的临床和生化特征见表1，可见三种基因型研究对象间性别、年龄、BMI、收缩压、舒张压、血糖、TC、TG、LDLC、HDLC、apoAI、apoB等差异无统计学意义(P均>0.05)。表1 42例不同基因型研究对象间临床和生化特征的比较

　　2.2基础状态下CD40基因1C/T多态性对单个核细胞表达CD40的影响

　　基础状态下，三种基因型单个核细胞培养24 h后，细胞表面CD40表达量均显著升高。CC、CT、TT三种基因型单个核细胞在0 h CD40表达量无显著性差异，培养24 h后，三种基因型单个核细胞CD40表达水平也无显著性差异，见表2。表2 基础状态下不同基因型单个核细胞表达CD40水平的比较(x±s,MFI)

　　2.3 IFNγ刺激状态下CD40基因1C/T多态性对单个核细胞表达CD40的影响及辛伐他汀的干预作用

　　100 μg/L IFNγ刺激状态下，单个核细胞培养24 h后CD40表达量呈显著升高水平，不同基因型单个核细胞CD40表达上升的幅度有显著性差异，分别为CC型上升6.41倍，CT型上升3.68倍，TT型上升2.35倍，20 μmol/L辛伐他汀显著抑制经IFNγ诱导后CD40的表达，然而对不同基因型单个核细胞的抑制程度没有显著性差异，对CC、CT、TT型的抑制率分别为46.4%、39.6%、36.8%。表3 三种状态下不同基因型单个核细胞培养24 h后表达CD40水平的比较(x±s,MFI)

　　3 讨论

　　急性冠状动脉综合征(Acute Coronary Syndrome,ACS)是以动脉粥样硬化斑块破裂或糜烂，继发完全或不完全闭塞性血栓形成为病理基础的一组临床综合征，炎症反应的激活可能是发生ACS的因素之一。最新的研究证实[3]，炎性细胞因子CD40在ACS发生发展过程中起到了激活炎症细胞、启动炎症反应的作用，是介导这一炎症反应的重要介质。在正常情况下，血管内皮具有抵抗白细胞浸润的能力，并且只少量表达CD40，血管内皮受到损伤时，如干扰素γ(IFNγ)的刺激下，CD40大量表达，并与其配体CD40L结合，进而激活粥样斑块中的巨噬细胞、内皮细胞以及T淋巴细胞分泌黏附分子、细胞因子(IL6、TNFα、IFNγ等)、基质金属蛋白酶和组织因子等[4]。因此，CD40CD40L的激活能加速动脉粥样硬化的发生发展，并触发斑块不稳定，裂缝形成，甚至破裂，导致ACS的发生。

　　激活的单核/巨噬细胞是CD40的重要来源之一，机体单个核细胞不仅容易获取、分离、培养，而且被激活后可与内皮细胞粘附并向内皮下迁移，这也是动脉粥样硬化发生的首要步骤。IFNγ可诱导单个核细胞募集，促进泡沫细胞和指纹形成，促进血管壁细胞产生炎性因子，还可显著促进单核细胞分泌CD40[5]。

　　我们的体外实验证实，经IFNγ刺激后，单个核细胞大量表达CD40，这与国外报道相一致[6]。IFNγ是ACS炎症反应中关键的介质之一，也是调节CD40生成的主要因子，实验结果提示，IFNγ能直接激活人外周血单个核细胞，参与机体的炎症反应。

　　基因组的变异是普遍存在的，且绝大多数变异都不具功能性，没有生物学意义，不影响基因表达产物的功能或表达水平。我们在前面的研究[7]中发现中国湖北地区汉族人群CD40基因启动子上游1位点存在单核苷酸C和T的互换，但此多态性在中国人中是否具有功能性、是否影响CD40基因的转录或翻译效率，尚需探讨。本实验发现携带CD40不同基因表型的单个核细胞经IFNγ刺激后，CD40表达上升的幅度有显著性差异， CC基因型上升的幅度最大，CT基因型次之，TT基因型上升幅度最小，据此可推测CD401C/T基因多态性可能在某种程度上影响CD40的表达。目前尚不明确CD40基因1C/T多态性影响CD40基因转录效率或翻译效率的机制，推测可能CD40基因1C/T多态性通过一些未知的DNA结合序列影响CD40基因的转录或翻译，也有可能该多态性并不真正影响CD40基因的转录，只因与CD40基因中另一个有功能的多态性连锁而得出上述结论。IFNγ可促进单核/巨噬细胞合成TNFα、ILβ及表达NFκB，我们在研究中虽没有检测这些因子的表达水平，但不排除CD40基因1C/T多态性通过与这些炎性因子的相互作用影响单个核细胞表达CD40效率的可能。CD40基因的转录和翻译调控复杂，启动子区任何微小的变异都有可能影响该系统的调节，要完全了解CD40基因1C/T多态性的功能需进行单体分析及分析与各种转录因子的共同作用。

　　随着分子生物学的发展和人类基因组计划的完成，药物基因组学成为研究的热点，不同患者对同一种药物的作用效果和药物代谢可能存在差异，而这种差异可能是由不同患者所携带的基因型不同引起的。他汀类药物是临床上常用的治疗冠心病的药物，具有很好的调脂和抗炎疗效[8]。本研究用20 μmol/L辛伐他汀观察其对单个核细胞表达CD40的调节作用，并进一步探讨其对不同基因表型单个核细胞的影响，发现辛伐他汀可显著抑制IFNγ诱导的CD40的表达，但在不同基因型单个核细胞中，辛伐他汀的抑制效率没有显著性差异，对CC、CT、TT型的抑制率分别为46.4%、39.6%、36.8%。本研究在体外证实了辛伐他汀的抗炎作用，下一步我们将探讨在非炎症状态下，即单一辛伐他汀处理细胞，观察其对基础状态下单个核细胞的影响。

　　综上所述，经辛伐他汀处理后，炎症因子CD40大幅度下降可以初步反映临床上ACS患者在他汀类药物治疗后的良好效应，提示应激状态下单个核细胞对早期他汀药物干预反应良好，炎症活动减弱，有助于斑块钝化，然而在临床上对不同基因型的患者使用辛伐他汀治疗，在抗炎效果上可能没有差异。

　　【参考文献】

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　　[2]徐国辰，刘文玲，梅其炳，等.药物基因组学对心血管病个体化治疗的启示[J].中国药学杂志,2005,40(3):172174.

　　[3] Yan JC,Wu ZG,Kong XT,et on between upregulation of CD40 system and complex stenosis morphology in patients with acute coronary syndrome[J].Acta Pharmacol Sin,2004,25(2):251256.

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　　[6] Lee SJ,Qin H,Benveniste tatin inhibits IFNgammainduced CD40 gene expression by suppressing STAT1alpha[J].J Leukoc Biol,2007,82(2):436447.

　　[7]李 艳，田彩霞，汪 明，等.CD40基因多态性与急性冠状动脉综合征、高血压和糖尿病的易感相关性[J].中华医学杂志,2007,87(10):690694.

　　[8]Sanguigni V,Pignatelli P,Lenti L,et term treatment with atorvastatin reduces platelet CD40 ligand and thrombin generation in hypercholesterolemic patients[J].Circulation,2005,111(4): 412419

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